亲和温敏聚合物PNIPAA,―co―AA,的制备及表征
摘 要：制备一种新型的蛋白质分离纯化材料。探讨亲和温敏双水相体系对牛血清白蛋白（BSA）的分配特性。优化分离纯化BSA条件，同时测定BSA的回收率以及纯化倍数，并通过电泳SDS-PAGE对BSA蛋白进行了表征。
中国论文
关键词：亲和温敏聚合物 牛血清白蛋白（BSA） 分配系数 电泳
中图分类号：O645.1 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2014）12（b）-0072-02
双水相萃取技术已被广泛地应用于生物化学各个领域，可用来分离蛋白质、酶、病*、脊髓病*和线病*的纯化、核酸、DNA的分离、干扰素、细胞组织、抗生素、多糖、色素、抗体等。双水相萃取技术作为一种新型的分离技术，可以利用不复杂的设备、并在温和条件下进行简单的操作就可获得较高收率和有效成分，克服了常规萃取有机溶剂对生物物质的变性作用，在萃取过程中保持生物物质的活性及构象等明显的技术优势。该文以金属离子为配基的亲和温敏聚合物作为双水相体系的成相物质来对蛋白质进行分离纯化，探讨了对牛血清白蛋白（BSA）的分配特性，优化分离纯化BSA的条件，同时测定回收率和纯化倍数，并通过SDS-PAGE对目标蛋白进行了表征。
1 实验方法
1.1 双水相体系的构建
亲和温敏聚合物PNIPAA，-co-AA，-Cu为自制。将PNIPAA，-co-AA，-Cu与无机盐溶液混合时，离子强度会不断增加，而使PNIPAA，-co-AA，-Cu分子内部以及PNIPAA，-co-AA，-Cu分子之间的疏水作用增强，导致PNIPAA，-co-AA，-Cu不能与之形成双水相体系而直接以絮凝沉降的方式形成相分离，因此选择了亲和温敏聚合物-葡聚糖-40 000双水相体系作为研究对象。
1.2 双水相体系的萃取原理
当萃取体系的性质不同时，物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力（如憎水键、氢键和离子键等）的存在和环境因素的影响，使其在上、下相中的浓度不同：其分配行为可由分配系数K（K=Ct/Cb，Ct、Cb分别为上相和下相分配物质的浓度，单位为g/L）来描述。分配系数K等于物质在两相的浓度比，由于各种物质的K值不同，可利用双水相萃取体系对物质进行分离。其分配情况服从分配定律，即，“在一定温度一定压强下，如果一个物质溶解在两个同时存在的互不相溶的液体里，达到平衡后，该物质在两相中浓度比等于常数”，分离效果由分配系数来表征。该文中，利用亲和温敏聚合物PNIPAA，-co-AA，-Cu和葡聚糖4万形成的双水相体系分离纯化BSA的研究中，可以通过两相中单位体积BSA的蛋白质含量的比值表示BSA的分配系数，继而计算得到BSA的回收率。
1.3 双水相体系相图的绘制
亲和温敏聚合物PNIPAA，-co-AA，-Cu和葡聚糖-40 000组成两相聚合物，并配置一定浓度的母液。PNIPAA，-co-AA，-Cu母液精确称量后加入试管中，加入葡聚糖40 000母液摇混均匀，直至出现混浊，计量葡聚糖40 00母液加入量，计算各自母液浓度，加水溶解至恰好澄清，计算水的加入量。继续加入葡聚糖40 000母液，再次变得浑浊，如此反复，得到恰好混浊时PNIPAA，-co-AA，-Cu和葡聚糖40 000在体系中的浓度含量，绘出PNIPAA，-co-AA，-Cu和葡聚糖40 000的双线相图。
2 结果与讨论
2.1 双水相体系相图的绘制结果
由实验可知，由PNIPAA，-co-AA，-Cu/葡聚糖40 000构成的双水相体系中，上相为亲和温敏聚合物富集相，下相为葡聚糖40 000富集相。如图1双水相相图所示PNIPAA，-co-AA，-Cu/葡聚糖40 000双水相相图符合一般高聚物/高聚物相图的规律，正是基于聚合物的不相容性。PNIPAA，-co-AA，-Cu和葡聚糖40 000分子之间存在空间阻碍作用，无法相互渗透，不能形成均匀的一相，因此PNIPAA，-co-AA，-Cu和葡聚糖40 000具有相互分离的倾向，故而在一定的条件和浓度下即可分离成两相。在PNIPAA，-co-AA，-Cu和葡聚糖40 000双水相体系中，双节线以下的区域为均相区，以上的区域为两相区，在曲线的上方区域中，任何葡聚糖4万与PNIPAA，-co-AA，-Cu相对应的含量进行试验，双水相体系形成。
2.2 葡聚糖4万浓度对BSA分配系数及回收率的影响
由表1可知，BSA的分配系数随着葡聚糖40 000浓度的提高而不断减小，说明随着双水相体系中葡聚糖40 000浓度增加，BSA不断从PNIPAA，-co-AA，-Cu富集相（即上相）中向葡聚糖40 000富集相（即下相）分配，同样上相中BSA的回收率也下降。由表1可知，，随着葡聚糖40 000浓度从6%增加至14%，BSA的分配系数从22.92下降到了3.97。同样，BSA的回收率也从80.4%下降到了48.2%。由于从葡聚糖40 000溶液中分离纯化得到BSA的难度增加，并且随着葡聚糖40 000浓度的增加，体系的粘度也不断升高，众所周知，高粘度体系不利于目标分配物质的相间传质过程，会影响目标分离物质的分配系数。因此考虑到要降低体系的粘度和节省物料以及提高BSA的分配系数，选择了葡聚糖40 000浓度为6.0%（w/w）作为双水相的最优下相浓度。
2.3 胎牛血清中BSA的分离纯化
图2是蛋白质SDS-PAGE后的双水相系统温度敏感的亲和纯化的分析结果，66 kDa的蛋白质的分子量，胎牛血清的电泳图显示该频带很宽，估计含有更多的杂质，另外还有蛋白污染带。双水相系统纯化后的蛋白条带，由于BSA颜色加深的相位特性，没有杂蛋白条带，表明亲和力和温度敏感的双水相系统可有效地用于富集和分离BSA。
3 结语
PNIPAA，-co-AA，-Cu/葡聚糖40000所构成的双水相体系中，上相为PNIPAA，-co-AA，-Cu富集相，下相为葡聚糖40 000富集相。通过实验绘制出了双水相的相图；BSA经过PNIPAA，-co-AA，-Cu/葡聚糖40 000构成的双水相体系纯化后，上相中得到的BSA蛋白的特征谱带颜色加深，而其杂质蛋白明显变淡，而下相中几乎不含有BSA分子的谱带，表明该亲和温敏双水相体系能有效用于BSA的富集和分离。
参考文献
[1] 秦德华.用双水相萃取丙酰螺旋梅素的研究[J].中国抗生素杂志，1998，23（2）：144-147.
[2] Cunha T，Ares-Barros ul R. Aqueous Two-phase Syste，s，ethods and Protocols[M].Totowa：Hu，ana press，2000：391-409.
[3] 成坚.双水相体系萃取分离技术及其在生物技术中的应用[J].仲恺农业技术学院学报，2000，13（2）：52-58.